激光共聚焦显微镜

Ü仪器简介

激光共聚焦扫描显微镜是以激光为光源，以照明点和探测点共轭光路为探测系统，对自发荧光样品或可被荧光标记的样品进行共焦、实时扫描的一种光学显微镜。它可以有效排除非焦平面信息，提高分辨率和对比度，使图像更为清晰，与计算机及相应软件技术结合，可以实现连续光学切片。其优越性表现为：

1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。

2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。

3、多维图象的获得（如7 维图象XYZaλIt）: xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描。

4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。

5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察；

6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。

本室购置的激光共聚焦扫描显微镜为日本Olympus公司生产，型号FV300。主要具有半定量共聚焦图像分析、动态观察生物结构变化、三维重建分析细胞结构等功能。结合本研究所的研究方向，目前多用于观察细胞周期相关蛋白在细胞各周期时相在细胞中的相对位置、细胞骨架（微丝、微管）的排列变化、细胞在受到外界刺激后内部信号蛋白变化过程等。

ÜFV300主要技术参数：

激光光源
• 可见光激光光源 (在激光耦合器中)：
o 氩离子激光器- 10 mW (488 nm)
o 氦氖激光器(绿) - 1 mW (543 nm)
o 氦氖激光器(红) - 10 mW (633 nm)

扫描单元
• 扫描机制：一对扫描振镜( x 和y)
• 视场数：20
• 针孔规格：5个大小不同针孔
• 扫描速度：
o 标准扫描模式- 256 x 256 (0.45 秒) to 2048 x 2048 (10.835秒)
o 双向高速扫描模式- 512 x 512 (0.25 秒) – 2个通道

• 图像的分辨率：每个通道12位(4096个灰度级)
• 变焦比：1x 到10x (0.5x步距)
• Z轴马达：25nm步距

• 发射滤过片：

FVX-BA510IF, FVX-BA530RIF, FVX-BA565IF, FVX-BA585IF，FVX-BA560-600IF, FVX-610IF, FVX3-BA660IF

显微镜
• 倒置- IX71FVSF，配置物镜：

UplanApo 10X/0.40 ∞/0.17
UplanApo 20X/0.70 ∞/0.17
UplanApo 40X/0.85 ∞/0.11-0.23
PlanApo 60X/1.40 Oil ∞/0.17

照明单元
• 透射光照明：外置卤素灯光源由光纤引入显微镜。
• 透射光探测器：外置PMT探测单元也由光纤引入显微镜。
• 荧光照明：外置汞灯光源由光纤引入显微镜。

控制单元
• 图像显示：
o 显示方式 – 每个通道可以进行图像排列、合并、剪切、平铺等
o LUT – 可以自行定义，可以添加伪彩
o 注释 – 可以添加线、文字、刻度尺等
• 图像处理：
o 滤镜- Average, low-pass, high-pass, Sobel, median, Prewitt, 2-D 拉普拉斯滤镜、edge enhancement等。
o 运算- 图像的数学和逻辑运算，以及DIC背景校正运算。
• 图像分析：整个区域的荧光强度，特定区域的直方图表示、区域周长的测量，以及延时观察分析等；TIEMPO (延时观察控制软件) 等。
• 3D重建：3-D动画，左/右立体重建和断面轮廓分析等。

ÜFV300共聚焦系统的特点：

FluoViewTM系统点扫描、针孔探测的共聚焦光路有效地消除焦面以外光的干扰，能够实现高分辨率、高对比度的图像。

• 使用不同的扫描模式来获取图像，诸如x-y, x-z, x-t, x-y-z, x-y-t, 和x-y-z-t等. 标准的图像格式包括TIFF 和 AVI, 并允许直接输出FluoViewTM图像进行离线分析。

• x-y 平面扫描由一对扫描振镜来实现，能够达到18的视场数。通过缩小扫描的区域同时保持最大的分辨率（2048 x 2048）不变，能够实现10倍光学变焦。

• 明场图像或者微分干涉（DIC）图像能够与共聚焦荧光图像一起获取。透射光的图像与共聚焦图像的叠加是非常有用的。

• FluoViewTM系统512 x 512分辨率下4幅/秒和0.5毫秒/线的速度能够满足延时观察的需要。能够实现对于活细胞内荧光随时间变化的动态和强度分析。

• 通过使用共聚焦软件包中PAPP软件，能够快速地设计和执行较为复杂的实验。某些延时观察实验，包括光漂白、光转化或者多区域获取图像都能够由PAPP软件来实现，并且可以保存成模块化程序。

• FluoViewTM系统同时支持TTL外部触发，同步输入输出信号。

• FluoViewTM 系统能够实现多种扫描方式，包括点扫描、线扫描、曲线扫描和矩形区域扫描等，以满足延时观察实验的需要。

• 扫描的图像分辨率可以达到2048 x 2048，并且每个通道含4096个灰度级 (12-bit)，真实地体现图像的细节。同时，为了降低多标记荧光图像的串色现象，可以采用序列扫描的方式分通道进行扫描获取图像。

• 独一无二的激光强度调节机制，使得该激光器能够用在光转化和光漂白等研究中，进行快速的激发强度控制。同时，优越的强度稳定特性也使得该激光器能够用在活细胞延时观察的研究中。

Ü激光共聚焦扫描显微镜管理规定

一、实验预约制度（使用仪器前请认真阅读本管理规定 ）

　
1、使用激光扫描共聚焦显微镜者请提前在预约表中预约（日期、使用者、计划使用启讫时间、观察样本、荧光染料探针、使用物镜），并将电子预约表交管理员，未预约不能随意使用仪器。

2、只允许预约7日内时间（管理员除外），超出7日的预约无效，任何人有权重新预约该时间（但需告知管理员，否则出现问题，后果自负）。

3、取消预约者请至少提前1日向管理员说明，并将预约划掉，对于取消预约但不按规定提前说明者按照预约时间照常收费（擅自取消预约很容易造成开机空置）。如果未能及时取消，允许自行联系其他人使用，并向管理员说明，以避免空开机。如因样品问题造成提前结束，需向管理员说明，可酌情收取1/3的费用。

4、预约时间半小时内未到，并未作说明者按擅自取消预约，照常收费，管理员有权做其它安排。

5、实验提前结束有义务通知下一个预约者，尽量减少仪器开机空置时间，否则将负责由于未能及时通知造成的问题。

6、细胞所学生预约的要求：根据导师们的要求，请同学们事先查看304门上的预约表确定时间，将电子预约表填好打印，由导师签字后，交给管理员（同时发送电子版到zhxy@bnu.edu.cn），方可正式预约登记，否则视为无效预约。

激光共聚焦显微镜（FV300）电子预约表

1、使用共聚焦请提前在此表中预约，预约需注明使用者、联系电话、使用启讫时间、需要使用的激光波长、物镜，未预约不能随意使用仪器。

2、实验结束后有义务通知下一个预约者，以尽量减少仪器开机空置时间。

3、如需取消预约，务必请通知仪器管理者，并确保仪器不会开机空置，尤其要避免发生开机过夜的状况，否则空置时间会被记录为您的使用时间，切切！！

让我们共同创造良好的实验环境，谢谢您的理解与合作。

日期	预约者	手机	预约时间			样本	荧光染料	激光波长	物镜	导师签字
日期	预约者	手机	开始	结束	时长h	样本	荧光染料	激光波长	物镜	导师签字
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二、实验登记制度：

室验结束后，认真填写实验登记并签字。如果发现漏登，则按预约时间收费，并停止预约2周。三次以上，半年内不允许使用仪器。

三、数据刻录：

基于系统的安全性要求，系统未安装杀毒软件。在实验结束后，如需刻录数据，光盘由本室提供，不可使用可擦写光盘，也不可使用移动硬盘一类的存储设备拷贝数据。据实记录光盘刻录数目。

一切因为登记不清造成的收费不能更改。　

四、标本要求及仪器使用规定

　自备样品，本系统仅用于制备好样品的观察分析，不负责样品染色等前期准备工作。

1. 标本准备：切片标本需加盖盖玻片，最好用专用抗荧光淬灭的封片剂；普通培养板及培养瓶只能用 10X 、 20X 物镜观察，如需用高倍物镜观察，必须用专用培养板（壁厚＜0.17 mm）。

2. 实验开始：请准时进行实验，以免仪器空开。操所规程：

Ÿ 开机：打开氩离子激光器电源（稳定至230V）——打开其他激光器电源——打开激光器控制开关（氩离子激光器先开启风扇）——开汞灯——开电脑——打开软件Fluoview 4.0

Ÿ 获取图像： 镜检——将显微镜转换至激光激发采集模式——在软件中设置相关参数——扫描获取图像——调整参数——获取最佳图像，保存

Ÿ 关机：关闭软件、电脑——关汞灯——关闭激光器控制开关（氩离子激光器待风扇停转后再关闭）——关闭其他激光器电源——关闭氩离子激光器电源

3. 实验中：每次实验的实验者请不要超过 2 人，进入实验室必须穿戴鞋套。无关人员请不要私自进入实验室。滤光片的更换和清理、物镜的安装、更换等仪器操作均由本实验室工作人员进行。

4. 实验结束：按照操作规程关闭激光器，填写实验登记并签字。清理物镜，保持清洁。

五、收费标准

收费以小时为单位计，最小单位是1小时，一年累计时间有半小时以上不足1小时按1小时计算。

1) 北京师范大学生命学院: 60元/小时。

2) 校内其他院、系、所: 80元/小时。

3) 校外单位:220元/小时。

4) 刻盘费:12元/次，每张光盘成本费5元。

六、注意事项

1. 放置激光共聚焦设备的房间内要根据技术要求严格控制温湿度，因为温度和湿度的变化对光学系统影响非常大，尤其该设备扫描头非常精密，有一点变化将严重影响仪器性能和软件对硬件的识别。

2. 除借阅图书、文件及样品扫描观察外，不准在任何时间随便进入共聚焦房间，进出请随手关紧拉门。

3、光源在开启后半小时内不要关闭。

4、只有60X物镜为油镜，请同学们在转换物镜时不要将镜油污染其他物镜，实验结束要清理物镜。

Ü联系方式：

负责人：张晓嫣
联系电话：010-58809729
13641209717
联系地址：北京师范大学科技楼B座307房间
电子邮件：zhxy@bnu.edu.cn